4.全身麻醉药对婴幼儿发育影响的性别差异研究进展

据统计，美国每年约有600万儿童在手术、成像检查和其他诊断过程期间需要接受全身麻醉。由于全身麻醉在对小儿进行操控时可控性好，易于实施，因此在临床工作中应用比较广泛。但婴幼儿各器官处于发育时期，尤其是大脑，神经元在发育期大量形成，麻醉药可能会带来相应的神经毒性。GAS试验、MASK研究和PANDA研究的结果表明，单次和短暂地接触麻醉可能与神经发育障碍和行为问题无关，但多次接受麻醉和手术的婴幼儿在精细运动能力方面可能出现障碍。2016年，美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）发布安全公告，警告“3岁以下儿童在手术中反复或长时间（大于3h）使用全身麻醉药或镇静药可能会影响儿童大脑的发育”。越来越多的动物研究（包括非人灵长类动物）已经表明，全身麻醉有可能导致发育中的哺乳动物大脑神经元凋亡和其他神经元退行性变化。尤其是在产后早期接触麻醉药会导致中枢神经系统形态和功能的长期变化，进而导致神经认知功能的衰退。一些人类临床研究，包括不同的观察结果，解释了婴幼儿时期麻醉手术与多年后的学习成绩减退或行为异常风险增加之间的关联。而近期研究发现全身麻醉对婴幼儿的影响可能具有性别差异，并通过改变表观遗传，对后代产生影响。

一、婴幼儿全身麻醉后的神经毒性具有性别差异

日本进行了一项大规模的出生队列研究，使用年龄和阶段问卷第3版（JapanAges ＆ Stages Questionnaires，3rd Edition，J-ASQ-3）评估婴儿时期进行全身麻醉手术与1岁时发育迟缓之间的关联，该问卷包括五个发展领域（沟通能力、粗大动作、精细运动、解决问题能力、个人与社会交往能力）。该研究得出结论：J-ASQ-3五个领域的发育迟缓百分比随着外科手术次数的增加而显著增加，特别是在运动领域。在最近一项英国的Avon亲子纵向队列研究中，4岁前接受全身麻醉的儿童，没有显著的神经退行性改变，但在运动能力和社会语言表达能力方面显著下降。以往研究者们更多地考虑麻醉药的种类、剂量，麻醉方式，麻醉和手术频率，麻醉持续累计时间，以及麻醉作用于婴幼儿临界年龄等变量对婴幼儿麻醉手术后的学习和认知功能的影响，但对婴幼儿性别这一变量未常规引入。人们普遍认为麻醉药会对发育中的大脑产生毒性作用，并导致严重的认知障碍，无论性别如何。但一些临床研究和动物实验发现，婴幼儿早期麻醉所产生的神经毒性呈现性别差异性，从而导致婴幼儿在学习、认知和行为等不同领域表现出不同性质的缺陷。

（一）女性

女性更容易受到空间记忆损伤，注意力缺陷/多动症等的困扰。在Boscolo及其同事的研究中，暴露在麻醉药下的雌性幼鼠在成年后比相应的雄鼠需要更长的时间才能了解莫里斯水迷宫中隐藏平台的位置，该研究表明雌鼠更容易受到空间记忆损伤。Gonzales及其同事在用丙泊酚麻醉出生后第7天（postnatal day 7，PND7）到出生后第13天（PND13）幼鼠后，发现在广场实验中雌鼠运动的显著增加，得出雌鼠往往更倾向于出现注意力不集中或者是多动症的表现。

（二）男性

男性更容易出现非空间记忆障碍，同时较易出现焦虑行为。新奇事物识别是一种强大的非空间记忆模式，其评估标准依赖于啮齿动物的探索倾向。Lee及其同事用异氟烷对出生后第7天的幼鼠进行4h的麻醉，该研究发现麻醉暴露的雄鼠不能区分新物体甚至是熟悉的物体，而麻醉暴露的雌鼠对物体的识别是不受影响的，这表明雄鼠会更容易出现非空间记忆的损伤。Ju和他的同事用七氟烷对PND5幼鼠进行麻醉，并在成年早期对其进行高架十字迷宫测试。与雌鼠相比，雄鼠在迷宫中的开放臂和封闭臂上行走的距离更短，在开放臂上花费的时间也更少，雄鼠探索行为的减少表明雄鼠经历全身麻醉后更易出现焦虑症状。Diana等也展开了高架十字迷宫测验，结果：与对照组相比，全麻组小鼠在迷宫中的行走距离较短，并且进入迷宫中的开放臂的小鼠数量也较少，同时与雄鼠相比，雌鼠行走的距离更短，进入开放臂的数量更少。结果表明，在全身麻醉下雌鼠比雄鼠更易出现焦虑行为。两个研究结果相矛盾，由于关于性别差异的研究并不多，可能结论会有不小的差异，希望有更多的临床研究对性别差异进行探索。

（三）神经毒性产生性别差异的机制

神经元经过麻醉后大多发生了凋亡，但仍有存活下来的神经元，并呈现一定的特殊性质，从而产生性别差异。婴幼儿麻醉可能会从基因表达层面，神经递质-受体系统的功能层面产生影响。

1.在基因表达层面

基因表达的复杂过程通过多种途径调节，其中较重要的是microRNAs（miRNAs）。miRNAs是一种小的、非编码的单链核酸，几乎参与了所有的细胞过程。它们通过与编码蛋白质的mRNA相互作用，起到转录后修饰的作用。大多数miRNAs通过引起mRNA裂解、不稳定或降低核糖体的翻译效率来下调mRNA的翻译。它们被发现与正常的神经发育以及神经病理过程有广泛的相关性，大多数miRNAs下调基因表达，单个miRNA可以靶向多个mRNA，因此对细胞功能有深远的影响。重要的是，miRNAs被认为参与了许多与围手术期医学相关的过程，包括急性神经损伤（AIN）等，并且已经成为围手术期医学研究的一个重要靶点。男性和女性生物体的差异是发育生物学的基本要素，在大多数系统、器官（包括大脑）的发育中，有明显的性别差异的证据。与许多发育过程一样，miRNAs表达模式遵循性别差异，无论是动物还是人类。动物和人类研究表明，男性和女性在发育上的根本差异可能导致对一些麻醉药的反应改变。最近一项研究评估了异氟烷麻醉对新生小猪海马中miRNA表达影响的性别差异。6只雄猪和6只雌猪，年龄3～5d，接受3h的2%异氟烷麻醉，未经麻醉的新生小猪（6只雄猪，6只雌猪）充当对照组，评估了海马中miRNAs的表达。在对照组中，雌猪和雄猪海马中miRNAs的表达高度保守。然而，17/326个miRNAs表现出性别差异：10个miRNAs在雄猪中高表达，7个miRNAs在雄猪中表达低于雌猪，证明miRNAs在表达模式上存在固有的性别差异性，异氟烷与雄猪和雌猪miRNAs不同亚群表达的变化有关。在雌猪中，14/326个miRNAs发生显著改变（3个下调，11个上调）；在雄猪中，17/326个miRNAs发生改变（7个下调，10个上调）。在接触异氟烷的雄猪和雌猪之间，显著改变的miRNAs没有重叠。该研究表明麻醉诱发海马中miRNAs表达的改变呈现性别依赖性。

2.神经递质-受体系统的功能层面

通过观察发现全身麻醉对突触兴奋模式呈现较大的差异性改变，是由于性别差异性所导致。Ju等进行一项研究，对小鼠进行2.5%七氟烷麻醉2h，6h后在海马区观察到，在雄鼠中，微型兴奋性后电流的频率明显增加，兴奋性突触分子的蛋白质/mRNA表达水平也在雄鼠中增加更显著，而微型抑制性后电流在雌鼠中的传播受到影响。该研究表明小鼠接触七氟烷会诱发海马中突触类别的表达及固有的传播性质呈现性别依赖性变化。

二、婴幼儿全身麻醉后神经毒性对表观遗传的影响

表观遗传学是与遗传学相对应的概念。遗传学是指基于基因序列改变所致基因表达水平变化，如基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定等。而表观遗传学则是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化，如DNA甲基化和染色质构象变化等，有时甚至是在隔代遗传中保持稳定，被认为是基因与环境相互作用的结果。麻醉药的应用也代表一种环境影响，尤其暴露在大脑发育的脆弱阶段，通过表观遗传机制转化为目标基因的表达变化，并可能在麻醉相关影响中发挥作用，如学习和认知行为障碍。

（一）婴幼儿全身麻醉可能会导致DNA甲基化改变

表观遗传的重要组成部分是DNA甲基化。DNA甲基化依赖于DNA甲基化酶（DNAmethyltransferase，DNMTs），其功能是将甲基附着在位于特定二核苷酸区域（CpG岛）的胞嘧啶上，形成5-甲基胞嘧啶（5mC），最终导致基因沉默。DNA甲基化的程度能够改变基因的表达，从而影响学习和认知行为功能。并且已经证实，突触基因的DNA甲基化可能是由大脑发育过程中的压力事件引起的，麻醉过程自然是一个压力性的事件。Klenke等的研究中，海马神经元在异氟烷中暴露后，发现来自炎症涉及的几个基因DNA甲基化程度变高，Cxcl12 mRNA表达的显著下降。张等进行了一项动物实验，即恒河幼猴和小鼠在三天内每天接受2.5%～3%的七氟烷，在麻醉后，对恒河幼猴和小鼠的前额皮质进行了转录体分析。麻醉会导致TYMS（一种参与叶酸介导一碳代谢途径的基因）基因减少，从而影响一碳代谢，TYMS为DNA甲基化提供甲基，DNA甲基化发生改变（甲基化增强），从而引起ERMN mRNA减少，ERMN为髓鞘发育的重要基因，最终导致髓鞘的缺失及认知功能障碍。接受异氟烷麻醉后在寡头前体细胞中观察到DNA甲基化降低和DNA甲基转移酶1的表达减少，以至于分化成成熟的寡头细胞的数量减少，成熟的寡头细胞参与髓鞘化。众所周知，髓鞘是中枢神经系统（central nervous system，CNS）神经冲动传递的重要结构，髓鞘功能的中断与神经和精神疾病有关。范等的研究发现，反复接受3%七氟烷的新生大鼠中会检测到DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferase 1，Dnmt1）和Dnmt3a的增加，以及DNA羟化酶Tet1的减少，两者共同促进了Shank2、Psd95、Syn1和Syp基因的超甲基化，这些基因随后降低了突触基因的表达，最终在以后的生活中损害了认知、社交和空间记忆。

（二）婴幼儿全身麻醉导致的DNA甲基化的改变可能会产生跨代遗传的效应

婴幼儿早期接触全身麻醉可导致成年阶段的学习和认知行为功能的改变，但在妊娠晚期或婴幼儿时期进行全身麻醉对其后代相应的学习和认知行为等影响尚不明确。最近进行了一项研究：将出生后第7天（PND7）的小鼠按照同等性别比例分为实验组（连续吸入3%七氟烷6h）和对照组（持续吸入氧气6h），此批小鼠被称为Gen0，Gen0雌鼠所生的第一批小鼠被称为Gen1。此研究数据表明，Gen1中神经元DNA甲基化水平都降低，从而得出幼鼠接触七氟烷可能导致跨代低甲基化的结论。实验组（Gen0）JunB mRNA和Arc mRNA在七氟烷的诱导下表达上调，而只有暴露在七氟烷下的Gen0雌鼠所生的雄鼠（Gen1）JunB mRNA表达量增加了74%，Arc mRNA表达量增加了71.6%。因此得出基因的性别依赖性的跨代遗传结论。综上所述，七氟烷麻醉会导致跨代表观遗传变化，这些变化主要表现为Gen0雌鼠后代的神经元低甲基化。这种假设有可能通过对目标转录的调节、Arc和JunB mRNA的调整产生直接或间接的影响。同时最近一项研究表明，产后接触七氟烷会改变男性生殖细胞中KCC2基因的甲基化状态，从而支持七氟烷是一种具有跨代影响的强大表观遗传调节器的假设，这些对突触可塑性至关重要的组件的跨代修改，部分可能导致已发现的新生儿与吸入麻醉药接触时发生的形态和认知缺陷。

三、展望

未来的研究中，不论是动物实验还是临床观察都应考虑将性别作为麻醉引起神经毒性的生物变量，并从解剖、分子、遗传和功能变化等层面收集与性别差异相关的较全面的数据，同时在今后需要进一步研究导致DNA甲基化的机制。DNA甲基化不仅导致当代基因表达发生变化，而且还可能跨代进行表观遗传，从而引起长期认知功能障碍，只有掌握DNA甲基化的机制我们才能进一步探索并采取相应的措施来减少孕妇与婴幼儿麻醉所带来的神经毒性。

（刘洋　徐海洋　麻海春）

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